使用ACQUITY UPC2超高效合相色譜快速分離營(yíng)養(yǎng)保健品中的維生素K1異構(gòu)體和維生素K2
來(lái)源：沃特世公司 發(fā)布時(shí)間：2015-12-09
天然產(chǎn)物中的維生素K1（葉綠醌）主要以反式結(jié)構(gòu)存在，而膳食補(bǔ)充劑通常使用合成的維生素K1，其中可能含有相當(dāng)數(shù)量的順式結(jié)構(gòu)。反式維生素K1具有生物活性，而順式K1并不具備。目前用于分離維生素K1異構(gòu)體的HPLC方法需要使用C30色譜柱。HPLC方法的典型運(yùn)行時(shí)間大約為20 min，并且有些方法還需要使用氯化溶劑。
超高效合相色譜（UltraPerformance Convergence Chromatography，UPC²）是一種分離技術(shù)，它利用壓縮CO2處于或接近超臨界狀態(tài)時(shí)的特有屬性（即低粘度和高擴(kuò)散性）以及亞2 μm顆粒填充色譜柱，顯著提高了分離效率、速度和選擇性。
本應(yīng)用紀(jì)要介紹了一種快速分離維生素K1反式和順式異構(gòu)體以及四烯甲萘醌（MK-4，維生素K2的一種常見(jiàn)形式）的方法，該方法使用UPC²和ACQUITY UPC² HSS C18SB色譜柱，在3 min內(nèi)即可完成分離。維生素K1異構(gòu)體和MK-4的結(jié)構(gòu)如圖1所示。與目前所使用的基于LC的維生素K1反式和順式異構(gòu)體分析方法比相比，此UPC²方法更加快速、簡(jiǎn)單（無(wú)需使用C30色譜柱），并且所消耗的有機(jī)溶劑更少。
使用UPC²和單個(gè)UPC² HSS C18SB色譜柱（3.0×100 mm，1.8 μm）在3 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了維生素K1順式和反式異構(gòu)體以及MK-4的基線分離。如圖2所示，順式結(jié)構(gòu)的維生素K1首先被洗脫，接著是反式結(jié)構(gòu)，最后是MK-4。關(guān)鍵對(duì)（順式和反式維生素K1）之間的USP分離度為1.7（表1）。在梯度程序中，在0.5% B中初始2 min的等度洗脫對(duì)于順式和反式維生素K1的基線分離是非常必要的。將流動(dòng)相B的輸送體積精確控制在0.5%對(duì)于關(guān)鍵對(duì)的分離至關(guān)重要。ACQUITY UPC²系統(tǒng)是目前市場(chǎng)上唯一能夠提供這種水平的精確控制的SFC系統(tǒng)。等度保持階段之后，本研究采用了流動(dòng)相B從0.5%增加至20%的通用梯度。此梯度范圍可在應(yīng)用中根據(jù)實(shí)際的目標(biāo)維生素K2同系物的保留時(shí)間作出相應(yīng)的修改。
圖2. 維生素K1異構(gòu)體和MK-4混合標(biāo)準(zhǔn)品的疊加色譜圖（n = 10）。
本研究還涉及MK-4，因?yàn)樗蔷S生素K2的一種常見(jiàn)形式，并且是與維生素K1結(jié)構(gòu)最相近的一種維生素K2。其它形式的維生素K2（如MK-7）具有較長(zhǎng)的側(cè)鏈，在色譜柱上的保留時(shí)間更長(zhǎng)。因此它們能夠很容易地與維生素K1分離。總運(yùn)行時(shí)間為4 min，比使用C30色譜柱的HPLC方法的典型運(yùn)行時(shí)間至少快五倍。每一次進(jìn)樣的有機(jī)溶劑消耗量少于1 mL，這只是使用LC方法時(shí)典型溶劑用量（15至30 mL）的一小部分。
表1. 維生素K混合標(biāo)準(zhǔn)品的重復(fù)分析結(jié)果（n = 10）。
混合標(biāo)準(zhǔn)品的十次重復(fù)分析表現(xiàn)出優(yōu)異的重復(fù)性（表1）。信噪比為10時(shí)，順式維生素K1、反式維生素K1和MK-4的定量限（LOQ）分別為0.06、0.06和0.04 μg/mL（表2）。這些化合物都獲得了良好的線性（R2 >0.998）（表2）。市售維生素K補(bǔ)充劑的分析也表現(xiàn)出良好的重復(fù)性和分離度（圖3）。經(jīng)測(cè)定，在這種產(chǎn)品中，順式K1占總維生素K1的11.2%（表3）。
表2. LOQ和線性。
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圖3. 維生素K片劑重復(fù)分析的疊加色譜圖（n = 3）。
表3. 維生素K補(bǔ)充片劑的重復(fù)分析結(jié)果（n = 3）。
利用UPC²技術(shù)，可在3 min內(nèi)使用ACQUITY UPC² HSS C18SB色譜柱快速分離順式和反式維生素1異構(gòu)體及MK-4。分析速度比目前所使用的HPLC方法快至少五倍，并且無(wú)需使用特殊的C30色譜柱。此UPC²方法具有出色的分離選擇性、分離度、靈敏度和重復(fù)性，而且所使用的溶劑遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于HPLC方法。UPC²可以用于食品成分檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)維生素K分析，它能提高實(shí)驗(yàn)室通量、降低運(yùn)行成本。